淫羊藿对骨髓间充质干细胞成骨分化的影响

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2014.06.026

中国组织工程研究 ›› 2014, Vol. 18 ›› Issue (6): 979-984.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2014.06.026

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淫羊藿对骨髓间充质干细胞成骨分化的影响

李会珍¹，李蒙²，李瑞玉¹，吴立萍³

¹邢台医学高等专科学校第二附属医院中西医结合研究所，河北省邢台市 054000；²武警新疆总队和田地区支队卫生队，新疆维吾尔自治区和田市 848011；³河北医科大学附属邢台市人民医院检验科，河北省邢台市 054031

修回日期:2013-12-23 出版日期:2014-02-05 发布日期:2014-02-05
通讯作者: 李瑞玉，教授，主任医师，硕士生导师，邢台医学高等专科学校第二附属医院中西医结合研究所，河北省邢台市 054000
作者简介:李会珍，女，1974年生，河北省邢台县人，汉族，1999年毕业于河北张家口医学院，硕士，副主任医师，主要从事妇产科临床教学科研方面的研究。

Effects of epimedium on osteogenic differentiation of bone marrow mesenchymal stem cells

Li Hui-zhen¹, Li Meng², Li Rui-yu¹, Wu Li-ping³

¹Institute of Integrative Medicine, Second Hospital of Xingtai Medical College, Xingtai 054000, Hebei Province China; ²Department of Health, Hotan Detachment of the Xinjiang Armed Police Corps, Hotan 848011, Xinjiang Uygur Autonomous Region, China; ³Department of Laboratory, Xingtai People’s Hospital, Hebei Medical University, Xingtai 054031, Hebei Province, China

Revised:2013-12-23 Online:2014-02-05 Published:2014-02-05
Contact: Li Rui-yu, Professor, Chief physician, Master’s supervisor, Institute of Integrative Medicine, Second Hospital of Xingtai Medical College, Xingtai 054000, Hebei Province China
About author:Li Hui-zhen, Master, Associate chief physician, Institute of Integrative Medicine, Second Hospital of Xingtai Medical College, Xingtai 054000, Hebei Province China

摘要/Abstract

摘要：

背景：中药淫羊藿一直以来被用于骨质疏松的治疗和骨缺损的修复。

目的：探讨淫羊藿对骨髓间充质干细胞成骨性分化的影响。

方法：应用数据库文献检索的方法获取淫羊藿对骨髓间充质干细胞成骨性分化影响研究的文献，对符合研究标准的文献进行深入的分析。通过检测淫羊藿诱导骨髓间充质干细胞成骨性分化过程中碱性磷酸酶、骨钙素、骨桥蛋白、转化生长因子β、骨形态发生蛋白、骨钙素、骨涎蛋白等，了解淫羊藿对骨髓间充质干细胞的增殖和成骨分化的机制。

结果与结论：淫羊藿对骨髓间充质干细胞的影响呈剂量依赖性，在诱导培养的早期淫羊藿苷可以提高细胞的磷酸酶活性，在诱导培养的晚期增加细胞钙化结节数，促进骨钙素分泌量，显著提高转化生长因子β1、骨形成蛋白2、胰岛样生长因子1、骨桥蛋白和骨涎蛋白等的表达水平。淫羊藿对骨髓间充质干细胞的增殖和成骨性分化有促进作用，可作为一种良好的骨诱导活性因子。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

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关键词: 干细胞, 骨髓干细胞, 骨髓间充质干细胞, 骨髓基质干细胞, 淫羊藿, 淫羊藿苷, 分化, 增殖, 成骨性分化, 骨形成, 骨吸收, 碱性磷酸酶, 骨钙素

Abstract:

BACKGROUND: Epimedium has been used in the treatment of osteoporosis and repair of bone defects.

OBJECTIVE: To explore the effects of epimedium on the osteogenic differentiation of bone marrow mesenchymal stem cells.

METHODS: A database search was performed to retrieve literatures addressing epimedium effects on the osteogenic differentiation of bone marrow mesenchymal stem cells. Then, the papers meeting the criteria were selected for in-depth analysis. During the osteogenic differentiation induced by epimedium, alkaline phosphatase, osteocalcin, osteopontin, transforming growth factor β, bone morphogenetic proteins, osteocalcin, bone sialoprotein were detected in the bone marrow mesenchymal stem cells to understand the underlying mechanism of epimedium in proliferation and osteogenic differentiation of bone marrow mesenchymal stem cells.

RESULTS AND CONCLUSION: Epimedium effects on bone marrow mesenchymal stem cells are shown in a dose-dependent manner. During the early induction, icariin can increase cell phosphatase activity; in the late induction, icariin can increase calcified nodules, promote osteocalcin secretion, significantly improve the expressions of transforming growth factor β1, bone morphogenetic protein 2, insulin-like growth factor-1, osteopontin and bone sialoprotein. Epimedium, which can be used as an excellent osteoinductive factor, improves the proliferation and osteogenic differentiation of bone marrow mesenchymal stem cells.

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Key words: stem cells, mesenchymal stem cells, myeloid progenitor cells, mesenchymal stem cell transplantation, drugs, Chinese herbal, medicine, Chinese traditional

中图分类号:

R318

李会珍，李蒙，李瑞玉，吴立萍. 淫羊藿对骨髓间充质干细胞成骨分化的影响[J]. 中国组织工程研究, 2014, 18(6): 979-984.

Li Hui-zhen, Li Meng, Li Rui-yu, Wu Li-ping. Effects of epimedium on osteogenic differentiation of bone marrow mesenchymal stem cells[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2014, 18(6): 979-984.

图/表（结果） 3

成骨细胞鉴定指标包括碱性磷酸酶、骨桥蛋白、骨形成蛋白、骨钙素、骨涎蛋白等，通过检测淫羊藿诱导骨髓间充质干细胞成骨性分化的细胞因子，分析淫羊藿对骨髓间充质干细胞的增殖和成骨分化的影响。

2.1 碱性磷酸酶和骨钙素 碱性磷酸酶为一种同源二聚体的糖蛋白，是参与骨代谢的重要蛋白，被认为是细胞外基质成熟的早期标志^[27]。碱性磷酸酶的活性可以代表成骨细胞早期的分化水平，随着成骨细胞分化的发展碱性磷酸酶表达会逐渐增强。目前，认为骨性碱性磷酸酶在体外钙化中起着关键性作用，主要机制在于碱性磷酸酶可分解有机磷酸酯释放无机磷，增加局部无机磷酸的浓度，为羟基磷灰石的沉积提供必须的磷酸，同时水解焦磷酸盐，解除其对骨盐形成的抑制作用，促进矿化，所以碱性磷酸酶活性升高可以为细胞间质含量改变做好准备，并且是启动矿化的必备条件^[28]。碱性磷酸酶活性的提高是骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化的重要标志^[29]。

骨钙素是骨基质中重要的非胶原蛋白成分，由49个氨基酸构成。仅有成骨细胞能够合成和分泌骨钙素，主要出现在矿化形成期，因此，骨钙素是成骨细胞成熟的标志，也是成骨细胞功能的特异性标志，在骨细胞的形成过程中具有重要作用^[30]。有学者研究认为骨钙素可能是骨的矿化以及骨吸收的关键因子，因为骨钙素能够促使成骨细胞的募集，增强破骨细胞的骨吸收能力^[31]。Stein等^[32]认为骨钙素可能是骨形成和骨吸收的耦合因子。碱性磷酸酶和骨钙素的表达程度都可以反映骨代谢的进程，而且骨钙素是比碱性磷酸酶更敏感、更特异的反映骨代谢的检测指标，能够反映瞬间的骨转换水平，在评价骨代谢进程方面具有重要意义。

马莉萍^[12]研究淫羊藿苷促进大鼠骨髓基质干细胞成骨性分化的作用与机制，取3月龄SD大鼠骨髓分离骨髓基质干细胞，原代培养第1次换液后分组并加入10，1， 0 μmol/L的淫羊藿苷。从培养第9天起用10^-⁸ mol/L地塞米松、10 mmol/L β-磷酸甘油和100 mmol/L抗坏血酸磷酸诱导骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化。采用MTT法及流式细胞术分析淫羊藿苷对大鼠骨髓基质干细胞增殖的影响；采用偶氮偶合法进行碱性磷酸酶阳性克隆组织化学染色；采用对硝基酚磷酸盐法测定细胞裂解液中碱性磷酸酶活性；采用免疫放射法测定培养液中骨钙素水平；von Kossa染色测定钙化结节数目；采用反转录-聚合酶链反应及实时定量聚合酶链反应检测淫羊藿苷对骨髓间充质干细胞与成骨相关的7种基因表达的影响。研究发现淫羊藿苷对骨髓间充质干细胞的影响呈剂量依赖性，其中以浓度为10 μmol/L时作用最强，10 μmol/L淫羊藿苷抑制骨髓间充质干细胞的增殖，但在培养的各时期均显著促进其成骨性分化。其表现在诱导培养的早期提高细胞的磷酸酶活性，增加碱性磷酸酶阳性克隆数，在诱导培养的晚期增加细胞钙化结节数，促进骨钙素分泌量和细胞外基质中钙盐沉积量，在骨髓间充质干细胞诱导培养的第8，12天均显著提高磷酸酶活性、骨钙素、转化生长因子β1、骨形成蛋白2、胰岛样生长因子1、骨桥蛋白和骨涎蛋白等成骨相关基因mRNA的表达水平。由此可见，淫羊藿苷是中草药淫羊藿抗骨质疏松的主要有效成分，促进骨髓间充质干细胞骨形成分化的机制是提高细胞内磷酸酶活性，增加碱性磷酸酶阳性克隆、钙化结节数量，提高成骨相关基因mRNA的表达。

2.2 转化生长因子β和骨形态发生蛋白 转化生长因子β家族是成骨细胞分化的基本调节因子，也是骨基质中含量丰富的细胞因子，可以通过多种效应途径实现调节功能，使成骨细胞和破骨细胞介导的骨形成和骨吸收处于平衡，并且提高成骨细胞特异性基因的表达，促进细胞外基质的合成，控制成骨细胞分化。骨形态发生蛋白是一种存在于骨基质中的糖蛋白多肽，骨形态发生蛋白的结构与转化因子在C端都含有7个高度保守的半胱氨酸残基，因此与转化因子同属于转化生长因子β超家族。骨形态发生蛋白可以促进骨形成，是骨髓间充质干细胞和成骨细胞分泌，并以非活性形式贮存在骨组织中^[33]。骨形态发生蛋白在生物体内的一项重要生物学作用是可以诱导未分化的间充质细胞分化成为软骨细胞和骨细胞，而且也是惟一能够单独诱导骨组织形成的局部生长因子。骨形态发生蛋白具有促进成骨细胞分化和诱导体外成骨的能力，还具有使成骨细胞的前体细胞定向分化为成骨细胞的能力。

杨丽等^[13]研究淫羊藿苷对大鼠骨髓间充质干细胞骨向分化过程中转化生长因子β1和骨形态发生蛋白2表达的影响，运用全骨髓贴壁法分离、纯化大鼠骨髓间充质干细胞，以20 mg/L淫羊藿苷作为骨髓间充质干细胞药物干预浓度，根据干预条件的不同将实验分为空白组、经典组(加经典成骨诱导剂)、淫羊藿苷组、淫羊藿苷+经典组，通过ELISA法检测各组转化生长因子β1和骨形态发生蛋白2的表达，结果见表1。

2.3 骨涎蛋白和骨桥蛋白 骨涎蛋白和骨桥蛋白均为磷酸化硫化的糖蛋白，能吸附羟基磷灰石，在结缔组织矿化中起着重要作用^[34-35]。骨涎蛋白特异性的分布在矿化组织和钙化的软骨与骨的交界区，是成骨细胞分化的标志，骨涎蛋白可以由成骨细胞合成分泌，在分化成熟的成骨细胞中表达量明显增加，可以作为骨细胞外基质参与骨的代谢，引导矿化，从而促进骨的形成^[36]。在体外实验研究发现成骨细胞在功能减低时骨涎蛋白的合成分泌量也会减少，阻碍了矿化，从而引起骨质疏松^[37]。骨桥蛋白是由成骨细胞和淋巴细胞所产生，是一种早期的T细胞激活因子，分布比较广泛，骨桥蛋白与骨形成和骨吸收有关，可以促进骨矿化^[38]。

吴昊等^[14]通过研究淫羊藿苷对骨髓间充质干细胞增殖和骨向分化能力的影响，观察其促骨髓间充质干细胞骨向分化过程中对细胞因子表达的影响，以转化生长因子β1、骨形成蛋白2作为筛选防治骨质疏松药物进行实验研究，确定干预药物不同浓度梯度中最佳促骨髓间充质干细胞骨向分化剂量，发现最佳浓度为1×10^-⁹ mol/L，检测诱导分化过程中碱性磷酸酶和钙化结节等指标的表达，结果见表2。

2.4 纤维连接蛋白 杨月琴等^[15]研究淫羊藿对骨髓间充质干细胞向成骨细胞方向分化以及纤维连接蛋白表达的影响，利用地塞米松可以诱导骨髓间充质干细胞向成骨细胞方向分化的作用，分别用淫羊藿含药血清和地塞米松干预诱导体外培养的骨髓间充质干细胞，分为淫羊藿组、地塞米松组和阴性对照组，在诱导培养后对细胞进行Giemsa染色、纤维连接蛋白表达免疫细胞化学染色和矿化结节染色。随着培养天数的增加，淫羊藿组和地塞米松组细胞中有大量的立方形和多角形细胞形成，各组均有大量矿化结节形成。三组细胞的纤维连接蛋白表达结果，见表3。

此外，胰岛样生长因子1是由70个氨基酸残基组成的单链多肽，受垂体生长激素的控制，对成骨细胞有中等促进有丝分裂作用，是骨细胞形成过程的重要生长因子。

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引言

淫羊藿别名仙灵脾，是多年生草本植物，是小檗科植物心叶淫阳藿、箭叶淫羊藿、柔毛淫羊藿、巫山淫羊藿、粗毛淫羊藿、朝鲜淫羊藿的干燥茎叶提取物，性味辛、甘、温，归肝、肾经，中医认为肾藏精，主骨，生髓，淫羊藿苷是通过补肾阳达到强筋骨的作用^[1]，部分防治骨质疏松的中药复方中含有淫羊藿成分，是中医治疗骨质疏松方剂中经常使用的中草药^[2]。淫羊藿其主要化学成分是黄酮类化合物，以淫羊藿苷含量最高，分子式为C₃₃H₄₀O₁₅，相对分子质量676.67，分子结构见图1。淫羊藿苷具有类雌激素样结构和作用^[3-5]，可以抗骨质疏松，促进骨形成，与成骨细胞表面的雌激素受体结合，影响成骨细胞的凋亡和多种蛋白的表达^[6]。

骨髓间充质干细胞在特定的条件下具有分化为成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞、肌细胞和腱细胞等多种细胞的潜能^[7]，可以为骨生长及骨修复提供细胞来源。成骨细胞是骨形成的主要功能细胞，分布在骨形成的表面，可以生成细胞外基质的有机成分，负责骨基质的合成、分泌和矿化，成骨细胞鉴定指标包括碱性磷酸酶、骨桥蛋白、骨形成蛋白、骨钙素、骨涎蛋白等。破骨细胞分布在骨吸收陷窝内，负责骨吸收。有大量的实验证据表明骨髓间充质干细胞与骨质疏松症之间有密切联系。也有研究显示，淫羊藿苷还可以促进骨髓间充质干细胞成软骨分化，软骨分化的程度呈浓度依赖性增加^[8]。文章通过文献检索分析的方法探讨淫羊藿对骨髓间充质干细胞成骨性分化的影响。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程
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材料方法

讨论

淫羊藿苷具有促进骨形成，抑制骨吸收的生物学特性，淫羊藿次苷Ⅱ是淫羊藿苷在体内代谢的主要产物^[16-17]，在促进骨形成的活性方面高于淫羊藿。翟远坤等^[18]研究淫羊藿次苷Ⅱ对体外培养骨髓间充质干细胞成骨性分化过程中雌激素信号通路的影响，贴壁筛选法体外培养骨髓间充质干细胞，采用1×10^-⁵ mol/L的淫羊藿次苷Ⅱ进行药物干预，观察各组雌激素通路相关因子的表达量和成骨性指标。研究结果发现淫羊藿次苷Ⅱ可以明显增强碱性磷酸酶活性，促进骨钙素、Ⅰ型胶原蛋白的分泌和钙盐沉积，与成骨性分化相关的因子表达量也升高，而且这些效应均可被雌激素通路的特异性阻断剂所抑制，可见，淫羊藿次苷Ⅱ是通过激活雌激素信号途径来促进骨形成，抑制骨吸收，具有抗骨质疏松的作用。

淫羊藿诱导骨髓间充质干细胞成骨性分化过程中，通过检测成骨细胞鉴定指标，碱性磷酸酶、骨桥蛋白、骨形成蛋白、骨钙素、骨涎蛋白等，可以了解淫羊藿对骨髓间充质干细胞的增殖和成骨分化的机制。碱性磷酸酶是细胞外基质成熟的早期标志，可以代表成骨细胞早期的分化水平，是启动矿化的必备条件，碱性磷酸酶活性的提高是骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化的重要标志。骨钙素是成骨细胞成熟的标志，也是成骨细胞功能的特异性标志，在骨细胞的形成过程中具有重要作用。碱性磷酸酶和骨钙素的表达程度都可以反应骨代谢的进程，而且骨钙素是比碱性磷酸酶更敏感、更特异的反映骨代谢的检测指标，能够反映瞬间的骨转换水平，在评价骨代谢进程方面具有重要意义。转化生长因子β可以通过多种效应途径实现调节功能，使成骨细胞和破骨细胞介导的骨形成和骨吸收处于平衡，具有促进成骨细胞分化和诱导体外成骨的能力。骨涎蛋白是成骨细胞分化的标志，在分化成熟的成骨细胞中表达量明显增加，可以作为骨细胞外基质参与骨的代谢。骨桥蛋白与骨形成和骨吸收有关，可以促进骨矿化。实验研究证明，淫羊藿对骨髓间充质干细胞的影响呈剂量依赖性，在诱导培养的早期淫羊藿苷可以提高细胞的磷酸酶活性，在诱导培养的晚期增加细胞钙化结节数，促进骨钙素分泌量，显著提高转化生长因子β1、骨形成蛋白2、胰岛样生长因子1、骨桥蛋白和骨涎蛋白等的表达水平。淫羊藿对骨髓间充质干细胞的增殖和成骨性分化有促进作用，可作为一种良好的骨诱导活性因子。

国内关于淫羊藿对骨髓间充质干细胞成骨性分化影响研究的文献并不多。吴涛等^[19]选择清洁级成年雄性中国青山羊，淫羊藿浓度为100，10，1，0.1 μmol/L，0.1 μmol/L淫羊藿苷可以明显促进羊骨髓间充质干细胞增殖，增加S期和G₂，M期细胞数量，随着浓度的增加，促细胞增殖活性降低。100 μmol/L淫羊藿苷表现为明显的抑制细胞增殖作用。淫羊藿苷呈剂量依赖性促进羊骨髓间充质干细胞碱性磷酸酶活性和骨钙素表达。10，100 μmol/L淫羊藿苷诱导钙化结节形成能力优于0.1 μmol/L和1 μmol/L淫羊藿苷，可见，淫羊藿苷对羊骨髓间充质干细胞的增殖和成骨分化具有促进作用，可被视为一种良好的骨诱导活性因子。蒋绍艳等^[20]选择2月龄清洁级SD大鼠，淫羊藿浓度为10 μmol/L，研究发现骨髓间充质干细胞由梭形或纺锤形变成多边形或方形等形态，细胞重叠，细胞之间界限模糊，逐渐形成多个散在的细胞结节，胞质中出现钙盐结晶体，胞浆中可见棕黄色细小颗粒，碱性磷酸酶染色阳性，在细胞密集区反应强烈，淫羊藿苷能够诱导大鼠骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化。明磊国等^[21]研究男性40岁患者骨髓标本，淫羊藿浓度为5×10^-⁵，1×10^-⁵，5×10^-⁶，1×10^-⁶，5×10^-⁷，1×10^-⁷ mol/L。原代培养细胞呈典型成纤维细胞样形态，淫羊藿苷剂量依赖性抑制骨髓间充质干细胞增殖，能显著促进其向成骨性分化，表现为提高骨髓间充质干细胞的碱性磷酸酶活性，增加钙化结节数量，5×10^-⁵ mol/L淫羊藿苷显著促进骨髓间充质干细胞的成骨性分化，淫羊藿苷是中药淫羊藿抗骨质疏松的有效成分。陈克明等^[22]选择Wistar大鼠，淫羊藿浓度为10^-⁸，10^-⁷，10^-⁶，10^-⁵，10^-⁴mol/L，淫羊藿苷无促进细胞增殖活性，但10^-⁵ mol/L及更高浓度抑制细胞增殖，10^-⁵ mol/L淫羊藿苷强烈促进原代培养骨髓间充质干细胞的成骨性分化，淫羊藿苷强烈促进骨髓基质干细胞的成骨性分化，表明其具有促进骨形成生理活性。毛项颖等^[23]选择小鼠间充质细胞株C3H10T1/2，淫羊藿浓度为0，10^-⁷，10^-⁶，10^-⁵，10^-⁴ mol/L，10^-⁵ mol/L淫羊藿苷联合成骨诱导液促进干细胞成骨分化能力最强，10^-⁵ mol/L淫羊藿苷促进间充质干细胞株C3H10T1/2向成骨细胞分化，其作用与激活p38和抑制细胞外调节蛋白激酶表达有关。仇志强^[24]选择12月龄清洁级健康杂种犬，淫羊藿浓度为2.58，4.18，6.77，10.95，17.72 mg/L，原代培养细胞呈典型成纤维细胞样形态，坏死骨培养液可促进骨髓间充质干细胞增殖，但对其分化无明显影响，淫羊藿苷可抑制骨髓间充质干细胞增殖，淫羊藿能提高骨髓间充质干细胞的碱性磷酸酶活性和染色阳性率，增加钙化结节的数量，淫羊藿苷在骨坏死微环境中同样可促进骨髓间充质干细胞的成骨性分化，说明淫羊藿苷可能作为一种增强骨髓间充质干细胞治疗股骨头坏死疗效的辅助药物。许应星等^[25]选择3月龄SD雌性大鼠，淫羊藿浓度为10 mg/L，淫羊藿总黄酮能显著增加骨髓间充质干细胞碱性磷酸酶的表达以及成骨早期分化因子Runx2 mRNA的表达，在成骨诱导条件下，EFs呈时间依赖性下调DKKl的表达，通过抑制DKKl蛋白的表达调控去势雌性大鼠骨髓间充质干细胞成骨分化平衡，可能是淫羊藿总黄酮治疗绝经后骨质疏松症的分子机制之一。马慧萍等^[26]选择2月龄SD大鼠，淫羊藿总黄酮1 g/kg，含量为58.63%。淫羊藿总黄酮大鼠血清2.5%、5.0%和10.0%浓度，淫羊藿总黄酮直接加入培养液对骨髓间充质干细胞增殖无明显影响，淫羊藿总黄酮大鼠血清强烈刺激细胞增殖，成倍增加碱性磷酸酶染色阳性克隆数，淫羊藿总黄酮不影响骨髓间充质干细胞的成骨性分化，但淫羊藿总黄酮大鼠血清显著提高碱性磷酸酶活性、骨钙素分泌量和钙盐沉积量，淫羊藿总黄酮活性代谢产物强烈刺激骨髓间充质干细胞的增殖和成骨性分化，是淫羊藿总黄酮抗骨质疏松症的重要机制。

淫羊藿对骨髓间充质干细胞成骨分化的影响

Effects of epimedium on osteogenic differentiation of bone marrow mesenchymal stem cells

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